Glycine N-methyltransferase

Gen sitokrom P-4501A1 (CYP1A1) diatur oleh beberapa faktor, termasuk 4 S polycyclic aromatik hidrokarbon (PAH)-binding protein, yang baru-baru ini diidentifikasi sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT) (Raha, A., Wagner, C., Macdonald, RG, dan Bresnick, E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 5750-5756). GNMT cDNA, yang clone menjadi vektor pMAMneo yang berisi virus Rous sarcoma promotor dan gen resistensi neomisin, itu secara stabil menyalurkan ke sel ovarium D422 hamster cina (CHO). Blot Western analisis menunjukkan ekspresi tingkat signifikan dari 4 S protein dalam sel CHO transfected secara stabil (CHO-GNMT). Cytosolic persiapan dari CHO-GNMT tinggi menunjukkan benzo [a] pyrene (B [a] P) yang mengikat tapi tidak 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioksin (TCDD) aktivitas yang mengikat bila dibandingkan dengan klon transfected dengan pMAMneo vektor saja (CHO-neo) atau sel CHO orangtua. Challanging yang GNMT CHO-sel dengan 4 μm B [a] P mengakibatkan peningkatan kadar CYP1A1 mRNA. Sama efektif dalam mendorong CYP1A1 mRNA adalah benzo [e] pyrene dan 3-methylcholanthrene. Di sisi lain, TCDD tidak menginduksi ekspresi gen CYP1A1 dalam sel-sel ini. B [a] P-diperlakukan CHO-GNMT, mengungkapkan 4 S protein, juga menunjukkan CYP1A1 protein melalui Western blotting dan dipamerkan ethoxyresorufin-O-kegiatan deethylase; baik CHO-neo atau sel CHO orangtua positif untuk setiap tindakan tersebut. Pesan atau protein reseptor itu terdeteksi dalam CHO orangtua, CHO-neo, atau GNMT CHO-sel. Terlebih, tidak ada kegiatan mengikat XRE diamati pada TCDD-diperlakukan cytosolic persiapan atau nuklir ekstrak dari GNMT CHO-sel yang diperlakukan dengan TCDD. Studi ini tegas menetapkan bahwa GNMT adalah PAH-mengikat protein yang dapat menengahi induksi CYP1A1 oleh PAHs seperti B [a] P melalui reseptor-Ah jalur independen. GNMT pertama kali ditemukan dalam ekstrak hati guinea dan terlibat dalam oksidasi karbon metil dari metionin, meskipun account jalur ini hanya 20% dari total metil metabolisme metionin. Kemudian, GNMT ditunjukkan untuk bertindak sebagai folat mengikat protein dalam sitosol hati tikus. Bentuk enzim GNMT, iethe homotetramer, tidak aktif sebagai B [a] P-binding protein dan monomer tidak dapat berfungsi.

Media kultur jaringan adalah media α-minimal esensial, serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin tersebut dibeli dari Life Technologies, dan sumber dari bahan-bahan lain adalah : [α-32P] dATP dari biokimia ICN (Irvine , CA); [3H]B[a]P (60 Ci/mmol) dari Amersham Corp; [3H]TCDD (41 Ci/mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore ( Bedford, MA); S&S transfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH); BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Boehringer Mannheim Biochemica Corp (Indianapolis, IN); Tris, TEMED, Tween 20, B[a]P, B[e]P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma.

Kultur sel. Sel D422 CH, pada awalnya terisolasi setelah mutagenesis oleh seleksi SIB atas dasar sebagian perlawanan ke ADP (44). Persediaan kultur tetap dipertahankan pada 37°C dengan kelembaban 95% air dan 5% CO2 dalam medium minimal esensial, dilengkapi dengan 40 mg/l prolin yang mengandung 50 μg / ml gentamycin dan 10% serum janin sapi betis. Sel CHO sebagian dipilih sebagai target untuk transformasi karena kurangnya ekspresi gen endogen GNMT dan efisiensi transfection dengan pMAMneo/GNMT menggunakan teknik Lipofectin. 35 neomisin-klon resisten dipilih secara acak, terisolasi, dan tumbuh menjadi massa karakterisasi kultur lebih lanjut. Penyaringan awal dilakukan oleh RT-PCR analisis dari klon G418-tahan untuk 4 S PAH-binding protein dan gen β-aktin ekspresi.
Analisis RT-PCR dari 4 S dan β-aktin transkrip dari sel CHO. Total selular RNA (0,5 μg) telah ditaklukkan kepada analisis RT-PCR selama 35 siklus dalam total volume 50 μl, seperti dijelaskan dalam teks. A 10-reaksi μl sampel dari orangtua CHO, CHO-neo, dan GNMT CHO-sel ini dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa. 4 S dan β-aktin (β-A) mewakili 400 - dan 315-pasangan basa gen terpotong produk untuk 4 S dan β-aktin, masing-masing. Lane M, standar; jalur 1, RNA dari hati tikus; jalur 2, sel CHO RNA; jalur 3, CHO-neo RNA; jalur 4 dan 5, CHO-RNA sel GNMT diperkuat tanpa dan dengan reverse transcriptase, masing-masing.
Ekspresi GNMT (4 S protein) dalam GNMT CHO-Sel

Untuk menentukan secara langsung sel GNMT CHO-GNMT memproduksi protein, total protein selular denaturating dianalisis dengan elektroforesis gel, dan protein yang ditransfer ke membran dan nitroselulosa afinitas disucikan dengan antibodi poliklonal GNMT. CHO-sel GNMT mengungkapkan tingkat GNMT signifikan bila dibandingkan dengan tingkat tidak terdeteksi ada CHO-neo. Khusus B [a] P dan TCDD kegiatan mengikat ditentukan dalam berbagai sel CHO (Fig.3, A dan B). Signifikan B [a] P kegiatan diamati dengan ekstrak dari sel CHO-GNMT (jalur 3, Gambar. 3 A). Pada dasarnya tidak ada kegiatan mengikat jelas dengan ekstrak dari CHO (jalur 1) atau CHO-neo (jalur 2) sel. K Dfor B [a] P interaksi, sebagaimana ditentukan oleh analisis Scatchard, adalah 2,4 nm, dengan kapasitas mengikat 590 fmol / mg protein. Nilai-nilai ini dalam perjanjian dekat dengan 2,54 nm dan 530 fmol / mg protein diamati dengan sitosol hati tikus (30).

TCDD spesifik kegiatan mengikat cytosolic ditetapkan dalam ekstrak dari kontrol positif, HEPA-1 sel hepatoma. Pada dasarnya tidak ada kegiatan mengikat TCDD diamati di ekstrak baik dari CHO-GNMT, CHO-neo, Induksi CYP1A1 di GNMT CHO-Sel oleh PAHs. Analisis Blot Western CHO-sel GNMT diperlakukan dengan B [a] P. The CHO-sel GNMT diperlakukan dengan 4 μm B [a] P selama 6 h. Total selular protein (50 μg) dianalisis pada 8% SDS-Polyacrylamide gel, yang ditransfer ke Immobilon P membran, dan dengan CYP1A1 antibodi. Lane 1, hati microsomal fraksi (50 μg) dari B [a] P-tikus diperlakukan; jalur 2, total protein selular (50 μg) dari sel CHO; jalur 3 dan 4, total protein selular (50 μg) dari kendaraan - dan B [a] P-diperlakukan neo CHO-sel; jalur 5 dan 6, total protein selular (50 μg) dari kendaraan dan B [a] P-diperlakukan GNMT CHO-sel. Efek B [a] P pengobatan pada aktivitas CYP1A1 tergantung pada sebuah monooxygenase, EROD, ditetapkan dalam CHO, CHO-neo, dan GNMT CHO-sel. Pengobatan dengan PAH selama 6 jam menyebabkan 10-15 kali lipat dalam EROD induksi GNMT CHO-sel dibandingkan dengan jumlah diabaikan di sel neo CHO. Efek B [a] P pengobatan pada EROD (CYP1A1) aktivitas dalam sel CHO
Receptor Aktivitas dan GMSA untuk XRE1.

Reseptor adalah protein yang ditandai baik berpartisipasi dalam dioksin-dimediasi induksi CYP1A1 dengan cara mengikat XREs terkait withCYP1A1. Kehadiran atau ketiadaan reseptor di CHO, CHO-neo, dan sel CHO-GNMT ditentukan oleh analisis Utara dan Barat. Tidak terdeteksi jumlah protein yang ditemukan di setiap sel-sel ini. Pembentukan reseptor XRE cukup rumit dibuktikan dengan ekstrak nuklir dibuat dari HEPA-1 sel yang telah treatedin vivo dengan TCDD (jalur 4). Sekali lagi, tidak rumit seperti diamati dengan TCDD-CHO-GNMT diobati ekstrak nuklir (jalur 8). Hasil ini jelas menunjukkan bahwa sel CHO-kurangnya setiap GNMT endogen Ah ekspresi reseptor dan bahwa PAH-induced expressionCYP1A1 terjadi melalui reseptor jalur independen.